胎兒染色體數(shù)目異常是引起自發(fā)性流產(chǎn)的最重要原因，主要發(fā)生機(jī)制是配子減數(shù)分裂過程中隨機(jī)性的發(fā)生染色體不分離。此外，若父母本身存在染色體的平衡易位，其后代則會(huì)有幾率遺傳到異位染色體而造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。臨床染色體檢測(cè)的方法很多，如核型分析，基因芯片等，但復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作和昂貴的價(jià)格使得這些技術(shù)在當(dāng)前無法廣泛應(yīng)用。

        近期，發(fā)表在Prenatal Diagnosis的一篇論文讓介紹了一種新的方法（CNVplex®）用于基因組全部24條染色體（22條常染色體和2條性染色體）的倍性檢測(cè)，揭示自發(fā)性流產(chǎn)是否由染色體異常引起。同時(shí)，這種方法可以檢測(cè)到染色體末端重復(fù)，提示父母一方或雙方可能存在染色體平衡易位，因此需要進(jìn)行核型分析，及時(shí)采取措施預(yù)防流產(chǎn)的再次發(fā)生。在檢測(cè)準(zhǔn)確性上，CNVPlex®與基因芯片一致，但成本卻是后者的十分之一。

        天昊研發(fā)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)將這種技術(shù)轉(zhuǎn)化為適用于臨床的染色體非整倍檢測(cè)試劑盒，方便快捷的對(duì)流產(chǎn)原因進(jìn)行排查，減輕孕婦心理負(fù)擔(dān)，提供遺傳學(xué)信息從而輔助臨床醫(yī)生提出合適的指導(dǎo)方案。天昊同時(shí)提供對(duì)流產(chǎn)組織樣本以及母親基因組DNA進(jìn)行個(gè)體鑒定(STR分析)，排除可能的母系污染，大大加強(qiáng)了結(jié)果的可信度。

        至今為止天昊診斷也已持續(xù)研發(fā)多種臨床篩查和診斷的產(chǎn)品，從孕前，產(chǎn)前到新生兒覆蓋整個(gè)生育過程。其中包括孕前夫婦遺傳病攜帶者篩查，男性不育相關(guān)基因檢測(cè)，新無創(chuàng)TM產(chǎn)前胎兒唐氏綜合征篩查，遺傳性耳聾90項(xiàng)檢測(cè)，新生兒遺傳病篩查，以及高發(fā)單項(xiàng)遺傳病檢測(cè)項(xiàng)目（如地貧，DMD，成骨不全，X脆性綜合征等）。天昊診斷一直致力于創(chuàng)新基因檢測(cè)科技，實(shí)現(xiàn)科研向臨床的轉(zhuǎn)化，以更好的防治出生缺陷，守護(hù)人類健康。

        下面小編帶大家回顧這篇研究，了解CNVplex®在其中的表現(xiàn)。


A copy number variation genotyping method for aneuploidy detection in spontaneous abortion specimens


一種用于散發(fā)性流產(chǎn)產(chǎn)物的染色體非整倍體篩查方法


Prenatal Diagnosis


3.043


上海交大醫(yī)學(xué)院，國(guó)際和平婦幼保健院


CNVplex®和aCGH


        研究者在24條染色體的的著絲粒兩側(cè)以及端粒附近設(shè)計(jì)探針，平均每條染色體覆蓋5-8對(duì)，共計(jì)170對(duì)（探針分布如下圖： 其中1-12號(hào)染色體，16和17號(hào)染色體有8對(duì)探針；18-20號(hào)染色體，X染色體上各有7對(duì)探針；13-15號(hào)染色體，21-22號(hào)染色體及Y染色體上各有5對(duì)探針），用以檢測(cè)每條染色體靶定區(qū)域的拷貝數(shù)情況。因此CNVplex®不僅可檢測(cè)24條染色體的數(shù)目異常，對(duì)于染色體的末端缺失或重復(fù)的情況也可以進(jìn)行檢測(cè)。


        染色體的異常，如染色體非整倍體已被證明是引起自發(fā)性流產(chǎn)的最主要原因，但對(duì)于流產(chǎn)的遺傳學(xué)原因的分析，臨床上并沒有廣泛開展。對(duì)流產(chǎn)物進(jìn)行染色體非整倍體的檢測(cè)有助于揭示流產(chǎn)的病理。在這項(xiàng)研究中，我們使用一種高通量連接探針擴(kuò)增法（High-throughput Ligation-dependent Probe Amplification ,HLPA）商業(yè)名CNVplex®，檢測(cè)流產(chǎn)物中24條染色體的倍性信息，并驗(yàn)證此方法在其中的表現(xiàn)（有效性及準(zhǔn)確性）。



        首先，研究者對(duì)23個(gè)正常DNA樣本進(jìn)行拷貝數(shù)的檢測(cè)，得到了正常樣本（拷貝數(shù)為2）的拷貝數(shù)值分布。下圖（Figure 2）為23個(gè)正常對(duì)照樣本的拷貝數(shù)結(jié)果（分布在24條染色體的170個(gè)探針上），可見拷貝數(shù)的范圍落在1.6-2.4之間（虛線）。所有對(duì)照樣本的拷貝數(shù)平均值為1.990 (s.d. = 0.131) 。根據(jù)所得結(jié)果研究者定義其值大于2.5為目標(biāo)區(qū)段的拷貝增加，低于1.5為拷貝缺失。具體為數(shù)值在 2.5-3.5提示檢測(cè)樣本為三體，0.5-1.5 提示為單體，對(duì)于嵌合體(樣本中部分細(xì)胞正常，部分為非整倍體的現(xiàn)象), 研究者通過三個(gè)連續(xù)探針拷貝數(shù)在2.3-2.5之間或者在1.3-1.5之間為標(biāo)準(zhǔn)，提示樣本可能為三體嵌合或者單體嵌合。為了確診待測(cè)樣本是嵌合體還是母系污染，需進(jìn)行FISH檢測(cè)或者STR分析。考慮到操作簡(jiǎn)便，且成本較低，研究者選擇了STR分析對(duì)母親和胎兒的DNA進(jìn)行鑒定以排除母血污染。

Figure 2. 23個(gè)正常對(duì)照樣本在170個(gè)探針位置相應(yīng)拷貝數(shù)值

注：盒型圖代表23個(gè)樣本在此位置的拷貝數(shù)中位數(shù)以及閾值范圍，Y染色體的拷貝數(shù)結(jié)果只統(tǒng)計(jì)了男性樣本


        本研究通過HLPA和aCGH分別檢測(cè)98例自然流產(chǎn)組織中染色體拷貝數(shù)情況，并對(duì)兩種方法的結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)中HLPA方法檢測(cè)得到的結(jié)果與aCGH完全一致，其中Figure 3A展示了其中一例樣本，aCGH和HLPA都清晰的顯示胎兒為2號(hào)染色體三體。

        98例樣本中49例被檢測(cè)到為染色體非整倍體，我們對(duì)染色體變異的類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)：包括2號(hào)染色體三體異常3個(gè)，3號(hào)染色體三體異常1個(gè)，6號(hào)染色體三體異常1個(gè)，8號(hào)染色體三體異常1個(gè)，9號(hào)染色體三體異常1個(gè)，10號(hào)染色體三體異常1個(gè)，11號(hào)染色體三體異常1個(gè)，12號(hào)染色體三體異常1個(gè)，13號(hào)染色體三體異常1個(gè)，14號(hào)染色體三體異常1個(gè)，15號(hào)染色體三體異常2個(gè)，16號(hào)染色體三體異常15個(gè)，19號(hào)染色體三體異常1個(gè)，10號(hào)染色體三體異常2個(gè)，21號(hào)染色體三體異常3個(gè)，22號(hào)染色體三體異常2個(gè)，X單體異常9個(gè)。16號(hào)三體為本研究檢測(cè)到最多的染色體數(shù)目異常(30.6%)，這與之前的研究是一致的。

        對(duì)樣本7120177（編號(hào)）而言，aCGH顯示其在2號(hào)染色體上Cy5/Cy3 熒光比例上升，但并不顯著 (Figure 3B). 相同的, HLPA檢測(cè)結(jié)果顯示靶定在2號(hào)染色體的8個(gè)探針拷貝數(shù)的平均值僅為2.51(分別為2.35, 2.62, 2.66, 2.40, 2.45, 2.47, 2.72 和 2.40)，其中3 個(gè)連續(xù)探針拷貝數(shù)在2.3-2.5之間。這些結(jié)果提示樣本7120177 可能為嵌合體。

Figure 3.待測(cè)樣本 7120158 (A)和7120177 (B) 分別運(yùn)用aCGH和HLPA得到的拷貝數(shù)結(jié)果

注：X軸代表各染色體（chr1-chr22，X,Y）,aCGH中Y軸的值為 log2(Cy5/Cy3)  (待測(cè)樣本與正常男性樣本的熒光比值). 數(shù)值超過綠色的線或者低于紅色的線分別代表待測(cè)樣本為三體或者單體。在HLPA檢測(cè)中，Y軸代表所計(jì)算出的拷貝數(shù)數(shù)值，黃線之間的為正常樣本拷貝數(shù)（2）的范圍
(B) 待測(cè)樣本7120177, aCGH檢測(cè)結(jié)果顯示2號(hào)染色體熒光信號(hào)有輕微上調(diào)，HLPA檢測(cè)結(jié)果顯示2號(hào)染色體拷貝數(shù)平均值為2.51，均提示該樣本為嵌合體或被污染。
 

        對(duì)待測(cè)樣本7120177進(jìn)行了Short tandem repeat (STR) 鑒定 , 以確認(rèn)是樣本本身是嵌合體或外源DNA污染導(dǎo)致。結(jié)果見表1。研究者發(fā)現(xiàn)此樣本在所有STR位點(diǎn)只顯示2個(gè)等位基因，因此樣本并沒有被外源DNA污染，從而確定其為2號(hào)染色體三體的嵌合體。

表1：樣本7120177  STR 檢測(cè)結(jié)果

 

        染色體核型分析是診斷染色體異常最經(jīng)典的方法，它可以檢出染色體數(shù)目異常以及大于4Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常，但需要活細(xì)胞培養(yǎng)，操作繁瑣，且費(fèi)時(shí)（約10天左右）；其他的技術(shù)如SNP芯片，aCGH，NGS法等，性價(jià)比都不高，也不適用于普遍快速篩查，而像FISH，MLPA等技術(shù)的限制性在于其通量不高，與這些技術(shù)相比，HLPA（CNVplex®）延續(xù)了MLPA的特點(diǎn)，特異性強(qiáng)，檢測(cè)波動(dòng)?。?lt;10%）。


        染色體核型分析是診斷染色體異常最經(jīng)典的方法，它可以檢出染色體數(shù)目異常以及大于4Mb的染色體結(jié)構(gòu)異常，但需要活細(xì)胞培養(yǎng)，操作繁瑣，且費(fèi)時(shí)（約10天左右）；其他的技術(shù)如SNP芯片，aCGH，NGS法等，性價(jià)比都不高，也不適用于普遍快速篩查，而像FISH，MLPA等技術(shù)的限制性在于其通量不高，與這些技術(shù)相比，HLPA（CNVplex®）延續(xù)了MLPA的特點(diǎn)，特異性強(qiáng)，檢測(cè)波動(dòng)?。?lt;10%）。


        這一體系通過參照位點(diǎn)檢測(cè)拷貝數(shù)，所以不適合檢測(cè)多倍體，這與MLPA、aCGH是一樣的；文章中使用的探針組分辨率有限，不能檢測(cè)染色體微缺失微重復(fù)或者平衡易位的情況。此外，這一技術(shù)本身無法排除外源DNA的污染，所以需要使用STR分析排除可能的母血污染（尤其當(dāng)核型為46，XX時(shí)）。但是，CNVplex®本身的高準(zhǔn)確性以及低成本，使得它非常適用于自發(fā)性流產(chǎn)的臨床普篩。

        天昊診斷自創(chuàng)立之初堅(jiān)持以技術(shù)創(chuàng)新作為公司發(fā)展核心動(dòng)力，基于目前國(guó)際流行的基因檢測(cè)平臺(tái)開發(fā)了多項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)，其中包括AccuCopy®多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，CNVPlex®高通量基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，iMLDR®多重SNP及突變分析技術(shù)，SNPscan®高通量SNP及突變分析技術(shù)，EasyTarget®多重基因片段快速富集技術(shù)， SNPseq®超高通量SNP及突變分析技術(shù)，CNVseq®超高通量基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)等具有國(guó)際水平的專利技術(shù)，希望通過自主研發(fā)的創(chuàng)新技術(shù)促進(jìn)國(guó)內(nèi)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)遺傳研究以及人類各種疑難疾病的致病機(jī)理的探索，同時(shí)利用這些技術(shù)開發(fā)適合臨床應(yīng)用的各類基因檢測(cè)產(chǎn)品，服務(wù)于我國(guó)人民大眾的健康事業(yè)，同時(shí)還致力于科研相關(guān)試劑的研制與開發(fā)工作。因此，公司始終將"創(chuàng)新基因科技，守護(hù)人類健康"作為公司長(zhǎng)期發(fā)展的核心理念。